養(yǎng)細(xì)胞的小伙伴，最怕遇到的，大概就是細(xì)胞污染了。

這細(xì)菌和真菌污染好辨別，處理起來雖然麻煩，但也不是毫無辦法。相比起來，支原體污染才是防不勝防。

顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細(xì)胞共存在同一培養(yǎng)體系下，還跟細(xì)胞搶吃搶喝?？蓱z弱小又無助的細(xì)胞根本不是支原體的對手，只能茍延殘喘，狀態(tài)一代不如一代，導(dǎo)致實(shí)驗結(jié)果出現(xiàn)偏差。

多數(shù)情況下，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞疑似支原體污染，直接丟掉然后清理環(huán)境即可。但在一些特殊實(shí)驗，比如：細(xì)胞保種、抗體藥生產(chǎn)、疫苗生產(chǎn)或是細(xì)胞治療過程中，則需要對細(xì)胞例行支原體檢測，以確保細(xì)胞的純凈。

支原體常規(guī)檢測法之經(jīng)典法

這里指的是基于經(jīng)典法試劑盒：Venor®Gem qEP的檢測方法。

關(guān)于qPCR大家應(yīng)該都不陌生：

實(shí)時熒光定量PCR

Quantitative Real-time PCR

是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。

在支原體經(jīng)典法檢測試劑盒中，無需RNA提取和反轉(zhuǎn)錄步驟，樣品僅需待檢測的細(xì)胞上清或是從上清中提取的DNA。

經(jīng)典法試劑盒：Venor®Gem qEP使用方法

一、樣品制備：

①濃縮：當(dāng)細(xì)胞長至90%時，即可收集上清開始檢測，可對樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮。

注：濃縮僅適用于支原體的完整性，避免濃縮前支原體被破壞（如熱滅活）。

②穩(wěn)定：細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。如果立即進(jìn)行DNA抽提，則忽略這一步。

③DNA 抽提：大量證據(jù)表明，DNA抽提可實(shí)現(xiàn)高的靈敏度。DNA抽提有多種方法，但應(yīng)適合支原體基因組。我們推薦：

Venor®GeM Sample Preparation kits （貨號56-1010/-1050/-1200) 適合手動DNA抽提

這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗證，具體流程參見試劑盒說明書。另外Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對照，也用于驗證DNA抽提步驟（內(nèi)控原理：已知濃度的細(xì)胞，包含內(nèi)部控制DNA序列，該序列不和現(xiàn)有的任何有機(jī)體序列同源，對檢測的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前，將該內(nèi)控細(xì)胞和樣品一起加入細(xì)胞裂解液中，被一起提取出來。和靶點(diǎn)樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗，內(nèi)控DNA序列的成功擴(kuò)增提示靶點(diǎn)DNA的提取成功）。

二、試劑制備與PCR

另外，下列儀器已經(jīng)通過PCR反應(yīng)驗證：

三、結(jié)果分析

FAM通道檢測支原體熒光信號。依據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對包括對照在內(nèi)的每個樣品的擴(kuò)增曲線進(jìn)行評估。

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。

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