細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。

利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái)，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

既可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，又起到了細(xì)胞保種的作用。

在不附加任何保護(hù)劑下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。

因此，凍存時(shí)，應(yīng)向培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在液氮中能減少冰晶的形成。

實(shí)驗(yàn)開始前，要先做好準(zhǔn)備工作：

將凍存管、離心管、移液管、移液器等耗材準(zhǔn)備齊全，放入超凈臺(tái)中，打開紫外線照射 30 分鐘。打開通風(fēng)機(jī)通風(fēng) 3 分鐘。用 75%酒精擦拭操作臺(tái)和雙手。準(zhǔn)備好冰盒。

將離心機(jī)調(diào)節(jié)至所需轉(zhuǎn)速，細(xì)胞*培養(yǎng)基、DMSO、胰酶等放于37℃水浴箱中預(yù)熱。

凍存步驟：

1、取出細(xì)胞，酒精消毒，放入超凈臺(tái)。

Tip1：應(yīng)在細(xì)胞生長(zhǎng)良好、致密度約為 80-90％，活力達(dá) 90%以上的狀態(tài)下凍存。細(xì)胞活力差的細(xì)胞在凍存后的成活率很小，因此，一定要在細(xì)胞旺盛分裂時(shí)期凍存。

2、配置細(xì)胞凍存液：按無(wú)血清培養(yǎng)基：血清 ：DMSO=7:2:1 的比例配置細(xì)胞凍存液。

Tip2：DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色，可以用 0.22 微米濾膜過(guò)濾，或者直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品。以 5-10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。

Tip3：因DMSO 本身就有滅菌的作用，因此使用前不需要進(jìn)行高壓滅菌。高壓滅菌反而會(huì)破壞它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保存效果。

Tip4：在常溫下，DMSO 對(duì)人體有害，應(yīng)注意生物安全防護(hù)。

Tip5：凍存液應(yīng)該提前配制，防止臨時(shí)配制產(chǎn)生的熱量損傷細(xì)胞。

Tip6：加大凍存液中血清的比例對(duì)于保存某些脆弱的干細(xì)胞以及一些比較珍貴的細(xì)胞很有好處的。

3、按照細(xì)胞傳代步驟，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、解離。

4、消化好的細(xì)胞離心后，棄掉上清液，用凍存液重懸。

Tip7：用移液器吸去上清液時(shí)，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀。

Tip8：用移液器輕柔吹打細(xì)胞，避免損傷細(xì)胞。

Tip9：混勻 DMSO 要快，因?yàn)?DMSO 對(duì)細(xì)胞有毒性，混合后應(yīng)盡快凍存。

5、可用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或計(jì)數(shù)儀器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)至細(xì)胞數(shù)量為5×10?個(gè)/ml為宜。

6、將細(xì)胞凍存懸液分裝入細(xì)胞凍存管中，一般2ml凍存管裝入 1 -1.5 ml細(xì)胞凍存懸液為宜。

7、放入專業(yè)的細(xì)胞凍存盒中，或者按照：

﹣4 ℃ 30 分鐘→20 ℃ 30 分鐘→﹣80 ℃過(guò)夜→液氮保存的順序進(jìn)行凍存。

Tip10：復(fù)蘇遵循快速解凍的原則，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。而細(xì)胞凍存則要緩慢冷凍，目的是使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶從而降低對(duì)細(xì)胞的傷害。

對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，每分鐘降 1-3℃是合適的。

優(yōu)質(zhì)的胎牛血清

Ausbian

剛剛有提到，在細(xì)胞凍存過(guò)程中，適當(dāng)提高血清的比例，更有利于提高對(duì)脆弱細(xì)胞的保護(hù)。

血清不僅提供營(yíng)養(yǎng)上的支持，作為細(xì)胞生長(zhǎng)的媒介之一，其品質(zhì)優(yōu)劣，直接影響細(xì)胞的長(zhǎng)勢(shì)，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)出。

因此，挑選一款品質(zhì)優(yōu)異的血清尤為重要。Ausbian進(jìn)口特級(jí)胎牛血清，采自5-8個(gè)月胎齡牛胚胎中的胎血，出廠前均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格質(zhì)控，并附詳細(xì)《檢測(cè)報(bào)告》，如pH值、滲透壓、內(nèi)毒素、病毒檢測(cè)、促細(xì)胞生長(zhǎng)能力、無(wú)菌等檢查，均有詳細(xì)說(shuō)明。

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