培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、器皿或其他容器，生存空間及營養(yǎng)有限，當(dāng)細(xì)胞增殖到一定密度后，分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液，使細(xì)胞更好地生存，這一過程稱之為“傳代"(passage或subculture)。

值得注意的是：每次傳代細(xì)胞在生長和增殖方面受到一定的影響。

（一）細(xì)胞生命期(life span of culture cells)

指細(xì)胞在培養(yǎng)過程中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間。一般根據(jù)細(xì)胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。

例如：二倍體成纖維細(xì)胞，在不凍存和反復(fù)傳代條件下可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維持一年左右的生命，細(xì)胞便開始凋亡(apoptosis)。

細(xì)胞在生存過程中經(jīng)歷以下三個(gè)階段

1.原代培養(yǎng)期(primary culture)

組織到第一次傳代 時(shí)間大約為1～4周

特點(diǎn)：細(xì)胞活躍移動,分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。

原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動基本相似。

各細(xì)胞的遺傳性狀互不相關(guān)，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，如果把這種稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細(xì)胞獨(dú)立生存性差。

2.傳代期(passage)

初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系(cell line)

特點(diǎn)：細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好。

一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。

凍存配方：

向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

存于在液氮中溫度可達(dá)到－196℃，可長期儲存。如解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)增殖生長，細(xì)胞性狀不受影響，成為保存細(xì)胞最主要的手段。

3.衰退期

特點(diǎn)：細(xì)胞仍生存—增殖減慢—不增殖—輪廓增強(qiáng)—衰退凋亡

注意：細(xì)胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneous transformation);

細(xì)胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性 (malignancy)。細(xì)胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuous cell line)。當(dāng)細(xì)胞獲得不死性后,細(xì)胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

（二）培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期

“ 一代"指細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時(shí)間。與細(xì)胞倍增一代不是一個(gè)含義。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次，經(jīng)歷三個(gè)階段：

貼附現(xiàn)象是復(fù)雜和受多種因素的影響。

細(xì)胞不貼附：底物表面不干凈，影響細(xì)胞貼附。

利于細(xì)胞貼附：底物表面帶有陽性物質(zhì)與特殊物質(zhì): 纖粘連蛋白(fibronectin FN)、細(xì)胞表面蛋白(cell surface protein CSP)

這些物質(zhì)有的存在與細(xì)胞表面,有的來自血清。

1.潛伏期(latent phase) ：

接種 經(jīng)過懸浮期(細(xì)胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形)貼壁。

初代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過 10～24小時(shí)或更多時(shí)間。

連續(xù)細(xì)胞系和癌細(xì)胞系經(jīng)過10～30分鐘貼附。

潛伏期特點(diǎn)：

長短與細(xì)胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。

(1)細(xì)胞貼附后進(jìn)入潛伏期,細(xì)胞無增殖。少見分裂相，細(xì)胞有運(yùn)動活動。

(2)初代培養(yǎng) 細(xì)胞潛伏期約為24～96小時(shí)或更長，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期約6～24小時(shí)。

(3)細(xì)胞接種密度大潛伏期短。

(4)細(xì)胞出現(xiàn)分裂相增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期。

2.指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)：

特點(diǎn)：細(xì)胞增殖最旺盛階段,分裂相增多，細(xì)胞分裂指數(shù)(mitotie index MI) ：表示每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。

條件：分裂相數(shù)與細(xì)胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關(guān)。

細(xì)胞分裂指數(shù)：

初代細(xì)胞：在0.1％～0.5％之間％ ,

連續(xù)分裂細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞：3 ～5％。

指數(shù)增生期是作為細(xì)胞一代活力很好的時(shí)期,是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好和最主要的階段。

指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細(xì)胞數(shù)量增多后生長空間變小，細(xì)胞相互接觸可連接成片。

正常細(xì)胞：細(xì)胞相互接觸能抑制細(xì)胞運(yùn)動，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition)。

腫瘤細(xì)胞：沒有這種現(xiàn)象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積(piled up)。

由于細(xì)胞不斷增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞受營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Density inhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。

3.停滯期(stagnate phase)

細(xì)胞量和密度達(dá)到飽和，細(xì)胞停滯增殖。表明細(xì)胞進(jìn)入到停滯期,細(xì)胞數(shù)量持平，也稱為平頂期(plateau）。

特點(diǎn)：細(xì)胞不增殖,有代謝活動。培養(yǎng)液中的營養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低，此時(shí)需要傳代,否則細(xì)胞將會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細(xì)胞會從底物脫落死亡。

注意：傳代過晚將影響下一代細(xì)胞的生長,至少要再傳 1～2代 。

通過換液淘汰死細(xì)胞和受損較輕的細(xì)胞。待細(xì)胞全部恢復(fù)后再用。在這一點(diǎn)上操作時(shí)一定要特別注意。

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