現(xiàn)在檢水多采用微生物培養(yǎng)法，常見所檢的細(xì)菌有軍團(tuán)菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌?，F(xiàn)在，qPCR方法更多的可用于水質(zhì)檢測(cè)以及上述微生物的定量檢測(cè)。

可以采用德國(guó)MB公司的水中微生物DNA提取試劑盒（英文名：AquaScreen® Fast Extract）用于從水樣中提取微生物DNA。該試劑盒遵循ISO/TS 12869:2012的設(shè)計(jì)要求。提取的DNA可用于下游的PCR或qPCR檢測(cè)。

一、適合的樣本：

包括飲用水、浴池水、泳池水及廢水等。

二、工作原理：

該試劑盒采用0.4μm濾膜截獲微生物，然后微生物被加入到濾膜上的離子活性劑和促溶劑裂解。隨后進(jìn)行DNA抽提。

DNA抽提由四步組成：1. 菌體裂解

2. DNA與離心柱的特異結(jié)合

3. 祛除殘留污染物和抑制劑

4. DNA的洗脫

整個(gè)過(guò)程大約30分鐘。

三、產(chǎn)品組成：

四、需用戶自己準(zhǔn)備的試劑耗材和儀器：

1. 水過(guò)濾設(shè)備（濾器、真空泵等）

2. 無(wú)水乙醇

3. 反應(yīng)管（1.5ml或2ml）

4. 離心機(jī)

5. 恒溫儀

6. 移液器及帶濾芯吸頭（100ml和1000ml）

7. 恒溫箱

五、樣本制備須知：

1. 飲用水、浴池水、泳池水及廢水可作為樣本。樣本性狀會(huì)影響結(jié)果的可靠性，并需要與ISO的水樣采集指南一致（ISO Norm 5667-1至5667-10）。

2. 水樣應(yīng)在2-8°C保存，在采集的2天內(nèi)檢測(cè)。不推薦使用防腐劑，因?yàn)闀?huì)使菌體裂解，而濾膜只能截留完整的菌體。

3. 若水樣中有懸浮顆?；蚬潭〒]發(fā)性成分，則需先用濾紙過(guò)濾。

4. 樣本不能離心。

5. 該試劑盒所需樣本體積建議為1000ml。樣本體積少應(yīng)為100ml。

6. 該試劑盒不會(huì)截獲水中游離的DNA。

7. 該試劑盒不能區(qū)分“活的可培養(yǎng)微生物”與“活的不可培養(yǎng)微生物”。

六、操作注意事項(xiàng)：

1. 該試劑盒只用于科研，并且應(yīng)僅由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)室人員使用。
2. 所有樣本應(yīng)視為有潛在危害性，應(yīng)小心處理。
3. 應(yīng)始終穿上合適的防護(hù)fu，戴一次性手套和護(hù)目鏡。
4. 請(qǐng)勿向廢棄液體中加漂白劑或酸性溶液。如有液體濺出，請(qǐng)用合適的去污劑和清水處理。
5. 廢棄物可根據(jù)當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)進(jìn)行處理。
6. Binding Buffer（結(jié)合液）含異丙醇和聚乙二醇辛基苯酚醚，易燃、有害、有腐蝕性。
7. Wash Buffer 1（洗液1）含硫氰酸胍，有害、有腐蝕性。

七、樣本制備步驟：

（一）操作步驟概覽

（二）操作步驟詳解

步驟1. 樣本過(guò)濾

1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤(rùn)濕濾膜。

1.2 將濾膜放置在濾器中，并過(guò)濾必要體積的水樣。

步驟2. 菌體裂解

* 提前準(zhǔn)備：預(yù)先將恒溫儀設(shè)置到70℃，將恒溫箱設(shè)置到37℃。

2.1將樣本過(guò)濾后的濾膜翻轉(zhuǎn)放置到試劑盒提供的Incubation Dish（平皿）中。

2.2 吸取2ml lysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。

2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。

2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。

2.5 將平皿中的400 μl裂解液轉(zhuǎn)移至Incubation Tube（孵育管），70 °C孵育10分鐘。

2.5a可選項(xiàng)：剩余裂解液可再取400μl用于DNA抽提，以獲得更多的DNA樣本。

2.6 樣本短暫離心，并加入400 μl Binding Buffer（結(jié)合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請(qǐng)勿離心樣本，并立即進(jìn)行下一步。

步驟3. DNA提取

* 提前準(zhǔn)備：（1）Wash Buffer 1（洗液1）和Wash Buffer 2（洗液2）第yi次使用前，用無(wú)水乙醇復(fù)溶（請(qǐng)參見瓶上標(biāo)簽）

（2）將恒溫儀設(shè)置到70℃，并將Elution Buffer（洗脫液）放在上面預(yù)熱。

3.1 將步驟2.6中的混合液（~800 μl）轉(zhuǎn)移到Collection Tube（收集管）內(nèi)的Spin Column（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。

3.2 離心柱離心≥10000 × g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.2a 可選擇：在步驟2.5a中，多取的一份樣本重復(fù)以上操作，不用換離心柱。

3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個(gè)新的收集管中。

3.5大速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。

3.6棄掉收集管。將離心柱插入到試劑盒提供的Sample Storage Tube（樣本保存管）中。

3.7吸取60μl已70℃預(yù)熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應(yīng)全部覆蓋洗脫液。

3.8室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。

3.9樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲(chǔ)存在2~8℃，可存放1周。長(zhǎng)期儲(chǔ)存是在≤-18℃。

八、樣本中的細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

樣本中的細(xì)菌定量需使用PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品和qPCR檢測(cè)試劑盒（推薦使用德國(guó)MB的PCR定量標(biāo)準(zhǔn)品和AquaScreen®qPCR檢測(cè)試劑盒，詳見“九、水中細(xì)菌精zhun測(cè)定，還需要的相關(guān)試劑”）

計(jì)算公式：基因組拷貝數(shù)/反應(yīng) × 比例因子× 校正因子× （1000/樣本體積（ml））

= 微生物數(shù)量/升

注：

1. 樣本中的基因組拷貝數(shù)：可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量

2. 比例因子：取1份400ml裂解液，比例因子=5

取2份400ml裂解液，比例因子=2.5

取3份400ml裂解液，比例因子=1.67

3. 校正因子：60ml洗脫液中取10ml用于qPCR反應(yīng)，校正因子=6

九、水中細(xì)菌精zhun測(cè)定，還需要的相關(guān)試劑：

總之，傳統(tǒng)水質(zhì)檢查需要2-3天，qPCR法只需要2-3個(gè)小時(shí)，提取DNA只需要大約半個(gè)小時(shí)，更精zhun，更快捷。以上信息供參考，感謝締一生物提供相關(guān)內(nèi)容。